中药指纹图谱及其建立原则
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2005年3月3日
曹进 饶毅 清华大学药物研究所，北京100084
中药经过长期实践，其有效性为人认可，并越来越受到国际国内社会的重视。中药注射剂指纹图谱技术规范的颁布，为中药研究、中药质量控制方法学上的突破奠定了坚实的基础。
l 中药指纹图谱建立概述
一个理想的指纹图谱应该不仅仅局限于对药物物质基础的相对显示，而应该将测定的参数通过一定的数据相关性比较，并联系药物从原材料到最终制成品整体过程的质量特性，对中药进行整体相关性、有效性的控制。
指纹图谱的建立应该针对分析样本的特性，采取不同的测定方式，以反映药物不同的特征，这需要分为中药材和成品两大块，老药和新药两个方面。
首先.中药材的指纹图谱的建立和统一规范标准的制订，是中药指纹图谱中至关重要的一个环节.它必须结合附的实施.大范围开展研究，针对不同中药材的栽培、特性、采集、炮制、药用部位等等，进行过程规范，而后由药政部门指定单位进行统一规范提取测定；对于具体中药品种所用药材，还应由厂家进行药材指纹图谱的测定，测定的内容主要是针对药材按成品工艺制备所得部分，作为工艺过程质量跟踪的依据.但是现在指纹图谱初建伊始，必须由药政部门、药材产地、中药厂家、科研单位四方协调讨论.统计品种、功用、药材炮制、采摘、提取方式、有效部位等各方面的数据，进行统一调整，做到生产同一品种时不同厂家可以利用同一的中药材标准进料，而不会影响各自产品质量.这种协调是至关重要的，因为在现阶段即使是生产同一品种的厂家，由于进货原料、生产工艺细节、生产经验等问题，或多或少存在同一品种在不同厂家生产的质量相差较大，所具有的疗效、甚至毒副反应上都有差别。我们曾就不同厂家生产的清开灵注射液进行了指纹图谱的测定，比较其结果发现不同厂家的指纹图谱不尽相同，而且经过一些文献资料的调研，发现其疗效也不是一致的c因此，在制订指纹图谱标准的时候，如何统一标准，如何利用指纹图谱来表征一个稳定的质量和相似的疗效，是值得深入研究的。
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其次，成品方面应该积极规范制备过程，对每一个药材在制备工艺过程中的状态进行有效跟踪.并对关键易变的环节进行指纹图谱的测定，研究全过程的质量变化；另外在对单味药材研究的同时.在工艺过程中，应进行中间产物的质量跟踪；二者的结合才能真正全面控制中药的质量。这里需要指出的是，对于一个复杂的体系.不同的样本采用相同的测定方法，为使其测定数据有较大的显示度，所采用的测定条件必然是不同的，因此.对相近样本尽可能条件统一，是研究中应该注意的方面；再者对于数据值的选取，需要深入研究，也就是说如何使数据真正做到显示质量的稳定与否，其代表性、显示性能否作为过程的控制特征。需要在研究中充分考虑。
指纹图谱的建立对于新药和老药，采取的方式是不同的，这里的新药是针对中药新药2、3类而言的.它的指纹图谱的建立只能根据文献记载的资料、有效部位、提取方法结合制备工艺来制订，采取的方式也必定是根据药物大致物质特性而选取的通用方法。例如我们在对一个四味药的复方新药进行指纹图谱研究的过程中，首先进行了大量的文献调研，对其中提取的成分进行了大致归类，选取方解中的君药主要指标成分作为检测目标，波长及相关条件优化均在总体分离的情况下，对君药成分进行集中优化.重点是为了控制主要药效成分的质量指标；在方法上.由于只有提取实验和文献资料的信息.故选择了通用的高效液相色谱方法测定.对于老药，则和前者有所不同，因为已经在临床上收集毒副作用、治疗适应症等方面的资料.以及药代动力学等数据，可以将药物中成分归类为生物大分子、有机分子或者是无机离子等，根据归类结果采取适当的方法测定，这就在一定程度上将指纹图谱和药效进行了相关分析.为中药产品质量的稳定奠定了控制基础。
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2 中药指纹图谱制订
指纹图谱的制订是针对中药制剂的制备过程全面质量控制而设立的。它在整个质量控制环节中所起的作用是从整体上把握药物以及制剂工艺的稳定、可控，为的是将整个中药制剂的质量纳入可控制范围，但它的具体表现形式在现阶段仍具有一定黑箱性质，这一方面是由于中药的复杂性、易变性，另一方面是由于实际测定方法的可变性.中药的复杂易变来自于其中物质成分的复杂和相互作用，成分的不清楚必然会导致数据测定的盲目性；测定数据的完备性、特征性以及数据之间的相关性也肯定会受到影响，这要求在测定的过程中应该根据其中所含的成分种类和数量，选择一种或多种方法测定，每一种方法应该尽可能地将分析样本进行有效分离，以保证数据的稳定性。例如在利用HP比测定指纹图谱时，峰的纯度是影响峰响应值重现和准确的关键因素，一个峰中所含成分越多，其稳定性就越差，同时在对指纹图谱相似性研究的过程中，也会影响到数据的比较。我们在对指纹图谱的分离程度考查中，采取了多检测仪器综合评估的方式，如液相测定中，采用光二极管阵列检测器、蒸发光散射检测器以及液质联用仪，对同一液相分离条件进行考查，评价分离效果。其次就是在测定过程中供试品的处理和选取，均会影响到测定的稳定和对条件改变的适应程度。供试品的处理首先是要求将药物中有效成分完全提取.干扰成分完全去除，这对已知成分很少的复杂样本来说，是比较困难的.需要在相同测定条件下，对样本不同提取方法前后的图谱进行比较分析，才能最终确定大致需要跟踪检测的物质成分。我们在测定四昧药复方注射剂的指纹图谱时，就在全波长范围设定了4个跟踪波长，另外用三维紫外图谱进行了分析，将影响测定稳定的因素降低到最低程度。最后考虑的是物质成分在图谱中的完全显示，我们认为在同一个检测方式的条件下，应该使主要的药效成分均能显示出来，并有一定的控制，对于不能在同一测定条件下显示的样本.可考虑多张指纹图谱，主要药效成分的界定需要根据药材所含物质成分、文献记载、中医方解依据等综合判定。在测定以上提到的四味药注射剂指纹图谱的过程中，我们发现大部分主要物质都可以测定波长下出峰，但是有一味药材的主要成分，则在另外相隔较远的波长下出峰，我们根据方解对这味药材的解释，又根据三维图谱的显示及峰纯度的分析，发现其主要成分为两个生物碱物质，在全方指纹图谱测定波长以外的波长出峰，其余所含物质在测定波长下均有所显示、同时这两个物质峰在纯度对比上显示比较纯，几乎为单一成分峰，故而在含量测定项下，控制其含量，而在指纹图谱测定中，该药材仍用总的测定波长，控制其他成分的图形参数，没有采取两张指纹图谱的方式，这样也有效控制
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了该药材的质量.
另外，实际测定中，影响一个方法稳定性的因素有很多，从样品来源、组成、供试样制备、不同仪器、测定条件等等，都会对结果有所影响，所以测定方法在实际操作中的可变性，也是指纹图谱测定研究中的重要环节.对于复杂样品，其成分，种类.组成都知之甚少的情况下，建立指纹图谱必须综合考虑，例如对检测设备、检测方式、最佳检测条件、不同厂家设备对比等均要有所考查，再如具体到液相色谱柱，需要考虑其长度、内径、颗粒粒径、均匀度、担体形状、键合程度、包封率等，这些都会对测定产生影响。一个方法对样本的适应性，必须通过不同条件下的对比测定综合得出，比如在对一个液相条件考查的过程中，需要考虑温度、溶剂比例、添加剂比例、酸碱性等对分离程度改变的影响；在利用梯度的情况下，还需要考虑梯度的方式、梯度的坡度、溶剂比例置换的时间、比例滞后时间、梯度空白、成分冲洗完全与否等因素。总体上来说，一个的理论塔板数等作为指纹图谱的补克数据，并且对于图谱的可变性也应有一定的评价数据，以保证图谱的可靠性、重现性和稳定性。可变性包括对峰位的漂移、峰形的改变、峰纯度的变化、峰之间保留时间的交叉、位置改变、长期存放样品峰值峰数的变化等因素的考察，这需要在方法建立和考察过程中，并在随后结合药物稳定性实验进行。
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3 中药指纹图谱的意义及其阶段性目标
中药材和中药复方制剂能发挥治疗效果的物质基础是其化学成分。现行的中药质量标准中列入了显微鉴别、理化鉴别、含量测定等多种方法。尚不足以解决中药的复杂性.建立指纹图谱的意义就在于选准了中药质量标准现代化的突破u，将现代分析科学的优秀成果与中医药整体综合现有机融合，有效地运用了全面质量管理的理念，是一种充分利用现代科学技术手段所能达到的最好表现中药复杂体系特性的方法c前已述及，好的指纹图谱不但表达了成品的质量，更可以达到控制工艺操作和原药材的质控，即可从指纹图谱来追根溯源寻找工艺操作中的问题和实现对原药材GAP的质量要求。因此中药企业应看到建立中药指纹图谱势在必行，对企业的发展和提高竞争力是极为有利的。
指纹图谱的建立是具有一定的阶段性的。就目前而言，指纹图谱的研究还尚处于起步阶段。我们认为中药指纹图谱的研究及建立应该分为两个阶段，即初级阶段和高级阶段。
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首先在初级阶段，通过对大量注射剂的指纹图谱研究，建立系统的测定方法和全面的指标控制参数，寻找一定的数学模型，最终达到指纹图谱的可操作、可控、稳定、显性和量化的目的，提高整个中药注射剂的质量控制水平，并以此抛砖引玉，逐步建立其他类中药制剂的指纹图语。在指纹图谱研究的整个初级阶段，工作的重心应该放在建立测定方法，对方法稳定性和适用性的考查，有效部分基础研究，图谱多指标控制，数学建模，物理指标间相关性研究等多个方面，力求基本阐明中药的化学基础，质量控制参数。
指纹图谱研究的高级阶段即指纹特征和药效相关性研究的指纹图谱的生物等效性的研究.这也就是我们提出的多维多息化学特征谱的研究。所谓多维，即采用多种分析仪器联用的模式.目前最常用的是用高效液相色谱(或毛细管电泳)/二极管阵列检测器/质谱/质谱联用方式(HPLC或CE/DAD/MS/MS)所得的多维指纹图谱.这里包括了用HPLC或CE所得的色谱峰图(各个成分的保留时间)；二极管阵列检测器所得的在线紫外光谱图(online Uv图)，一级质谱图(各个成分的质量)和二级质谱图(某成分的特征碎片).所谓多息，即指中药的特征谱应努力做到包括化学和药效二方面的信息，化学信息即上面提到的多维谱图，如何使其也能包含药效信息，可采用有效部分“的概念来解决这个问题G即根据中药已知的疗效，确定相应的药效实验方法，根据组成中成药的各味药材或有效部分和成分的现有化学和药理资料，结合工艺，确定中药中可能存在的化学成分类别，采用现代分离手段(如超临界萃取、大孔树脂校、逆流色谱及各种制备色谱)将其分离成各个化学部分(化合物群)，分别做各种药效实验，最终确定中药中的各有效部分(即药效实验肯定的化学部分)和其所含的有效成分(各种化合物)的数量比例.这样得到的中药多维多息特征谱，包括了体现药效信息的多个有效部分的各种指纹图谱，更进一步解决了如何体现中药制剂的整体性和复杂性的难题., 百拇医药
中药经过长期实践，其有效性为人认可，并越来越受到国际国内社会的重视。中药注射剂指纹图谱技术规范的颁布，为中药研究、中药质量控制方法学上的突破奠定了坚实的基础。
l 中药指纹图谱建立概述
一个理想的指纹图谱应该不仅仅局限于对药物物质基础的相对显示，而应该将测定的参数通过一定的数据相关性比较，并联系药物从原材料到最终制成品整体过程的质量特性，对中药进行整体相关性、有效性的控制。
指纹图谱的建立应该针对分析样本的特性，采取不同的测定方式，以反映药物不同的特征，这需要分为中药材和成品两大块，老药和新药两个方面。
首先.中药材的指纹图谱的建立和统一规范标准的制订，是中药指纹图谱中至关重要的一个环节.它必须结合附的实施.大范围开展研究，针对不同中药材的栽培、特性、采集、炮制、药用部位等等，进行过程规范，而后由药政部门指定单位进行统一规范提取测定；对于具体中药品种所用药材，还应由厂家进行药材指纹图谱的测定，测定的内容主要是针对药材按成品工艺制备所得部分，作为工艺过程质量跟踪的依据.但是现在指纹图谱初建伊始，必须由药政部门、药材产地、中药厂家、科研单位四方协调讨论.统计品种、功用、药材炮制、采摘、提取方式、有效部位等各方面的数据，进行统一调整，做到生产同一品种时不同厂家可以利用同一的中药材标准进料，而不会影响各自产品质量.这种协调是至关重要的，因为在现阶段即使是生产同一品种的厂家，由于进货原料、生产工艺细节、生产经验等问题，或多或少存在同一品种在不同厂家生产的质量相差较大，所具有的疗效、甚至毒副反应上都有差别。我们曾就不同厂家生产的清开灵注射液进行了指纹图谱的测定，比较其结果发现不同厂家的指纹图谱不尽相同，而且经过一些文献资料的调研，发现其疗效也不是一致的c因此，在制订指纹图谱标准的时候，如何统一标准，如何利用指纹图谱来表征一个稳定的质量和相似的疗效，是值得深入研究的。
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其次，成品方面应该积极规范制备过程，对每一个药材在制备工艺过程中的状态进行有效跟踪.并对关键易变的环节进行指纹图谱的测定，研究全过程的质量变化；另外在对单味药材研究的同时.在工艺过程中，应进行中间产物的质量跟踪；二者的结合才能真正全面控制中药的质量。这里需要指出的是，对于一个复杂的体系.不同的样本采用相同的测定方法，为使其测定数据有较大的显示度，所采用的测定条件必然是不同的，因此.对相近样本尽可能条件统一，是研究中应该注意的方面；再者对于数据值的选取，需要深入研究，也就是说如何使数据真正做到显示质量的稳定与否，其代表性、显示性能否作为过程的控制特征。需要在研究中充分考虑。
指纹图谱的建立对于新药和老药，采取的方式是不同的，这里的新药是针对中药新药2、3类而言的.它的指纹图谱的建立只能根据文献记载的资料、有效部位、提取方法结合制备工艺来制订，采取的方式也必定是根据药物大致物质特性而选取的通用方法。例如我们在对一个四味药的复方新药进行指纹图谱研究的过程中，首先进行了大量的文献调研，对其中提取的成分进行了大致归类，选取方解中的君药主要指标成分作为检测目标，波长及相关条件优化均在总体分离的情况下，对君药成分进行集中优化.重点是为了控制主要药效成分的质量指标；在方法上.由于只有提取实验和文献资料的信息.故选择了通用的高效液相色谱方法测定.对于老药，则和前者有所不同，因为已经在临床上收集毒副作用、治疗适应症等方面的资料.以及药代动力学等数据，可以将药物中成分归类为生物大分子、有机分子或者是无机离子等，根据归类结果采取适当的方法测定，这就在一定程度上将指纹图谱和药效进行了相关分析.为中药产品质量的稳定奠定了控制基础。
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2 中药指纹图谱制订
指纹图谱的制订是针对中药制剂的制备过程全面质量控制而设立的。它在整个质量控制环节中所起的作用是从整体上把握药物以及制剂工艺的稳定、可控，为的是将整个中药制剂的质量纳入可控制范围，但它的具体表现形式在现阶段仍具有一定黑箱性质，这一方面是由于中药的复杂性、易变性，另一方面是由于实际测定方法的可变性.中药的复杂易变来自于其中物质成分的复杂和相互作用，成分的不清楚必然会导致数据测定的盲目性；测定数据的完备性、特征性以及数据之间的相关性也肯定会受到影响，这要求在测定的过程中应该根据其中所含的成分种类和数量，选择一种或多种方法测定，每一种方法应该尽可能地将分析样本进行有效分离，以保证数据的稳定性。例如在利用HP比测定指纹图谱时，峰的纯度是影响峰响应值重现和准确的关键因素，一个峰中所含成分越多，其稳定性就越差，同时在对指纹图谱相似性研究的过程中，也会影响到数据的比较。我们在对指纹图谱的分离程度考查中，采取了多检测仪器综合评估的方式，如液相测定中，采用光二极管阵列检测器、蒸发光散射检测器以及液质联用仪，对同一液相分离条件进行考查，评价分离效果。其次就是在测定过程中供试品的处理和选取，均会影响到测定的稳定和对条件改变的适应程度。供试品的处理首先是要求将药物中有效成分完全提取.干扰成分完全去除，这对已知成分很少的复杂样本来说，是比较困难的.需要在相同测定条件下，对样本不同提取方法前后的图谱进行比较分析，才能最终确定大致需要跟踪检测的物质成分。我们在测定四昧药复方注射剂的指纹图谱时，就在全波长范围设定了4个跟踪波长，另外用三维紫外图谱进行了分析，将影响测定稳定的因素降低到最低程度。最后考虑的是物质成分在图谱中的完全显示，我们认为在同一个检测方式的条件下，应该使主要的药效成分均能显示出来，并有一定的控制，对于不能在同一测定条件下显示的样本.可考虑多张指纹图谱，主要药效成分的界定需要根据药材所含物质成分、文献记载、中医方解依据等综合判定。在测定以上提到的四味药注射剂指纹图谱的过程中，我们发现大部分主要物质都可以测定波长下出峰，但是有一味药材的主要成分，则在另外相隔较远的波长下出峰，我们根据方解对这味药材的解释，又根据三维图谱的显示及峰纯度的分析，发现其主要成分为两个生物碱物质，在全方指纹图谱测定波长以外的波长出峰，其余所含物质在测定波长下均有所显示、同时这两个物质峰在纯度对比上显示比较纯，几乎为单一成分峰，故而在含量测定项下，控制其含量，而在指纹图谱测定中，该药材仍用总的测定波长，控制其他成分的图形参数，没有采取两张指纹图谱的方式，这样也有效控制
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了该药材的质量.
另外，实际测定中，影响一个方法稳定性的因素有很多，从样品来源、组成、供试样制备、不同仪器、测定条件等等，都会对结果有所影响，所以测定方法在实际操作中的可变性，也是指纹图谱测定研究中的重要环节.对于复杂样品，其成分，种类.组成都知之甚少的情况下，建立指纹图谱必须综合考虑，例如对检测设备、检测方式、最佳检测条件、不同厂家设备对比等均要有所考查，再如具体到液相色谱柱，需要考虑其长度、内径、颗粒粒径、均匀度、担体形状、键合程度、包封率等，这些都会对测定产生影响。一个方法对样本的适应性，必须通过不同条件下的对比测定综合得出，比如在对一个液相条件考查的过程中，需要考虑温度、溶剂比例、添加剂比例、酸碱性等对分离程度改变的影响；在利用梯度的情况下，还需要考虑梯度的方式、梯度的坡度、溶剂比例置换的时间、比例滞后时间、梯度空白、成分冲洗完全与否等因素。总体上来说，一个的理论塔板数等作为指纹图谱的补克数据，并且对于图谱的可变性也应有一定的评价数据，以保证图谱的可靠性、重现性和稳定性。可变性包括对峰位的漂移、峰形的改变、峰纯度的变化、峰之间保留时间的交叉、位置改变、长期存放样品峰值峰数的变化等因素的考察，这需要在方法建立和考察过程中，并在随后结合药物稳定性实验进行。
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3 中药指纹图谱的意义及其阶段性目标
中药材和中药复方制剂能发挥治疗效果的物质基础是其化学成分。现行的中药质量标准中列入了显微鉴别、理化鉴别、含量测定等多种方法。尚不足以解决中药的复杂性.建立指纹图谱的意义就在于选准了中药质量标准现代化的突破u，将现代分析科学的优秀成果与中医药整体综合现有机融合，有效地运用了全面质量管理的理念，是一种充分利用现代科学技术手段所能达到的最好表现中药复杂体系特性的方法c前已述及，好的指纹图谱不但表达了成品的质量，更可以达到控制工艺操作和原药材的质控，即可从指纹图谱来追根溯源寻找工艺操作中的问题和实现对原药材GAP的质量要求。因此中药企业应看到建立中药指纹图谱势在必行，对企业的发展和提高竞争力是极为有利的。
指纹图谱的建立是具有一定的阶段性的。就目前而言，指纹图谱的研究还尚处于起步阶段。我们认为中药指纹图谱的研究及建立应该分为两个阶段，即初级阶段和高级阶段。
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首先在初级阶段，通过对大量注射剂的指纹图谱研究，建立系统的测定方法和全面的指标控制参数，寻找一定的数学模型，最终达到指纹图谱的可操作、可控、稳定、显性和量化的目的，提高整个中药注射剂的质量控制水平，并以此抛砖引玉，逐步建立其他类中药制剂的指纹图语。在指纹图谱研究的整个初级阶段，工作的重心应该放在建立测定方法，对方法稳定性和适用性的考查，有效部分基础研究，图谱多指标控制，数学建模，物理指标间相关性研究等多个方面，力求基本阐明中药的化学基础，质量控制参数。
指纹图谱研究的高级阶段即指纹特征和药效相关性研究的指纹图谱的生物等效性的研究.这也就是我们提出的多维多息化学特征谱的研究。所谓多维，即采用多种分析仪器联用的模式.目前最常用的是用高效液相色谱(或毛细管电泳)/二极管阵列检测器/质谱/质谱联用方式(HPLC或CE/DAD/MS/MS)所得的多维指纹图谱.这里包括了用HPLC或CE所得的色谱峰图(各个成分的保留时间)；二极管阵列检测器所得的在线紫外光谱图(online Uv图)，一级质谱图(各个成分的质量)和二级质谱图(某成分的特征碎片).所谓多息，即指中药的特征谱应努力做到包括化学和药效二方面的信息，化学信息即上面提到的多维谱图，如何使其也能包含药效信息，可采用有效部分“的概念来解决这个问题G即根据中药已知的疗效，确定相应的药效实验方法，根据组成中成药的各味药材或有效部分和成分的现有化学和药理资料，结合工艺，确定中药中可能存在的化学成分类别，采用现代分离手段(如超临界萃取、大孔树脂校、逆流色谱及各种制备色谱)将其分离成各个化学部分(化合物群)，分别做各种药效实验，最终确定中药中的各有效部分(即药效实验肯定的化学部分)和其所含的有效成分(各种化合物)的数量比例.这样得到的中药多维多息特征谱，包括了体现药效信息的多个有效部分的各种指纹图谱，更进一步解决了如何体现中药制剂的整体性和复杂性的难题., 百拇医药